Question

11．下面是將乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白基因HBsAg導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母菌生產(chǎn)乙肝疫苗的過程及有關(guān)資料，請分析回答下列問題．
資料1　巴斯德畢赤酵母菌是一種甲基營養(yǎng)型酵母菌，能將甲醇作為其唯一碳源，此時AOX1基因受到誘導(dǎo)而表達(dá)[5'AOX1和3'AOX1（TT）分別是基因AOX1的啟動子和終止子]．
資料2　巴斯德畢赤酵母菌體內(nèi)無天然質(zhì)粒，所以科學(xué)家改造出了圖1所示的pPIC9K質(zhì)粒用作載體，其與目的基因形成的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后可以與酵母菌染色體發(fā)生同源重組，可以將目的基因整合于染色體中以實(shí)現(xiàn)表達(dá)．

（1）如果要將HBsAg基因和pPIC9K質(zhì)粒重組，應(yīng)該在HBsAg基因兩側(cè)的A和B位置接上SnaBⅠ、AvrⅡ限制酶識別序列，這樣設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)是避免質(zhì)粒和目的基因自身環(huán)化．
（2）酶切獲取HBsAg基因后，需用DNA連接酶將其連接到pPIC9K質(zhì)粒上，形成重組質(zhì)粒，并將其導(dǎo)入大腸桿菌以獲取大量重組質(zhì)粒．
（3）步驟3中應(yīng)選用限制酶BglⅡ來切割重組質(zhì)粒獲得重組DNA，然后將其導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母菌細(xì)胞．
（4）為了確認(rèn)巴斯德畢赤酵母菌轉(zhuǎn)化是否成功，在培養(yǎng)基中應(yīng)該加入卡拉霉素以便篩選，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞中是否含有HBsAg基因，可以用DNA分子雜交方法進(jìn)行檢測．
（5）轉(zhuǎn)化的酵母菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時間后，需要向其中加入甲醇以維持其生活，同時誘導(dǎo)HBsAg基因表達(dá)．
（6）與大腸桿菌等細(xì)菌相比，用巴斯德畢赤酵母菌細(xì)胞作為基因工程的受體細(xì)胞，其優(yōu)點(diǎn)是在蛋白質(zhì)合成后，細(xì)胞可以對其進(jìn)行加工（修飾）并分泌到細(xì)胞外，便于提�。�

Answer 1

分析 分析題圖：圖中質(zhì)粒含有SnaB、AvrⅡ、BglⅡ和SacI限制酶切割位點(diǎn)，其中SacI位于啟動子上，BglⅡ位于終止子上．要將HBsAg基因和pPIC9K質(zhì)粒重組，只能用限制酶SnaB和AvrⅡ切割質(zhì)粒，要獲取含有5′AOX1--3′AOX1段基因，應(yīng)選用限制酶BglⅡ來切割．5′AOX1--3′AOX1段基因含有卡那霉素抗性基因，在培養(yǎng)基中加入卡那霉素以便篩選導(dǎo)入重組質(zhì)粒的目的菌．

解答 解：（1）重組質(zhì)粒上的目的基因若要表達(dá)，需要目的基因的首尾含有啟動子和終止子．而SnaBⅠ、AvrⅡ識別的序列在啟動子與終止子之間，只要在目的基因兩側(cè)A和B位置分別接上這兩種序列，并用SnaBⅠ、AvrⅡ這兩種內(nèi)切酶對質(zhì)粒和目的基因同時切割，便會各自出現(xiàn)相同的粘性末端，便于重組與表達(dá)，同時防止自身環(huán)化，因此在HBsAg基因兩側(cè)的A和B位置接上SnaBⅠ和AvrⅡ限制酶的識別序列．
（2）①用DNA連接酶將切割后的HBsAg基因和pPIC9K質(zhì)粒連接成重組質(zhì)粒；②導(dǎo)入大腸桿菌體內(nèi)，目的是利用大腸桿菌無性繁殖速度，短時間內(nèi)可獲取大量的重組質(zhì)粒．
（3）重組DNA的兩側(cè)分別是啟動子和終止子，除BglⅡ外，其它限制酶會破壞含有啟動子、終止子的目的基因．
（4）用DNA分子雜交技術(shù)檢測是否導(dǎo)入目的基因．
（5）資料1顯示，甲醇為該酵母菌的唯一碳源，同時誘導(dǎo)HBsAg基因表達(dá)．
（6）酵母菌為真核生物，細(xì)胞內(nèi)具有對分泌蛋白加工的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細(xì)胞器，細(xì)菌等原核生物，不具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細(xì)胞器．
故答案為：
（1）SnaBⅠAvrⅡ
（2）DNA連接酶    大量重組質(zhì)粒（重組質(zhì)粒不得分）    
（3）BglⅡ
（4）DNA分子雜交    
（5）甲醇       
（6）加工（修飾）

點(diǎn)評 本題結(jié)合將乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母菌生產(chǎn)乙肝疫苗的過程圖，考查基因工程的原理及技術(shù)，要求考生識記基因工程的原理、工具及操作步驟，能結(jié)合題干和圖中信息答題，有一定難度．